λYES（酵母一大肠杆菌穿梭载体)是构建cDNA文库的高效载体，这种载体是噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中

能的直接检测。免疫染色表明，这种蛋白质定位于细胞核内，如同推测的一样，是一种转录因子。如果能够测出它所结合的DNA序列，就可以从现有的序列资料中查找已知基因启动子的天然位点，从而能够找到它所调节的基因。

  有人建议用PCR扩增同该蛋白质结合的微量DNA，思路是(图Q25.8)：①合成一组长为26个碱基的随机序列的寡聚核苷酸混合体，在该序列的两侧各有一段25个碱基的序列作为PCR扩增的引物位点[图Q25.8(a)]；②把这些寡聚核苷酸加到含有转录因子的细胞粗提取物中，转录因子可以同含有结合位点的寡聚核苷酸结合；③用转录因子特异的抗体分离同转录因子结合的寡聚核苷酸；④用PCR扩增选择到的寡聚核苷酸进行序列分析。

  图Q25.8 用随机的寡聚核苷酸选择和扩增特异的DNA序列(a)用于选择的原初随机序列的寡聚核苷酸，N代表任何一种核苷酸；EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ位点有利于选择DNA的克隆和序列分析。(b)同序列特异的DNA结合蛋白结合的寡聚核苷酸的选择和序列分析方案按照这一思路，用0.2ng单链随机序列的寡聚核苷酸开始了这项实验，这个寡聚核苷酸可以同一个PCR引物结合成部分双链，经过如图Q25.8(b)所示的四轮选择和复制后，用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ消化分离到的DNA，将片段克隆到质粒中，并测定了10个独立的克隆(表Q25.1)，问：

  表Q25.1 10个克隆的序列

  注：画线的序列是PCR引物部位，两种序列都是从BamH Ⅰ末端开始，所有序列中结合位点的方向都是相同的。

因此计划将它从BamH Ⅰ的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamH Ⅰ切割以后，立即用碱性磷酸酶处理除去5'磷酸；接着将处理过的载体同用BamH Ⅰ切割的cDNA片段混合，加入DNA连接酶后进行温育，连接之后，将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因，所以，转化的细菌能够存活。

  实验中同时设置了四个对照：

  对照1：将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上。

  对照2：将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。

  对照3：将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。

  对照4：将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。

  在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表Q25.2)。在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长(表Q25.2)。接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子(表Q25.2)。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA，并用BamH Ⅰ进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个cDNA片段，实验终于获得成功。

  表Q25.2 cDNA克隆的结果

  注：TMTC=too many to count，多到无法计数。

酸的短肽加到该蛋白质的N端或C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同Ni²⁺柱结合，但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。

  图Q25.9是编码该蛋白质的核苷酸序列。请设计一对PCR引物，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列。另外，在N端有一个起始密码，其后是6个组氨酸密码子。另设计一对引物，能够在C端加上6个组氨酸和一个终止密码。

  图Q25.9欲修饰蛋白质的N端和C端的核苷酸序列

  编码的氨基酸序列用一个字母标在下面。星号(*)代表终止密码。此图只标出了双链DNA上面的一条链

酸合成血红素。希望利用该突变体去克隆E.coli的hemA基因。首先用Sau3A Ⅰ部分酶切E.coli的DNA，得到的DNA片段平均为2kb，然后将这些片段从BamH Ⅰ位点克隆到质粒pBR322中，连接后转化hemA突变体。根据氨苄青霉素抗性来选择重组体。将筛选到的氨苄青霉素抗性克隆重植在加有δ-氨基乙酰丙酸的平板上进行测试。请问：已经测试的Amp^r抗性转化子中有多少不再需要在培养基中添加琥珀酸?(E.coli基因组的全长为4500kb。)

在囊胚期的发育还是正常的，但此后的发育是不正常的，形成一个短尾的胚，也就是缺少后面的四段。在脊椎动物中，成纤维细胞生长因子(FGF)刺激中胚层的诱导和后期的发育，同时认为，Raf-1蛋白参与了由FGF启动的信号传递。Raf-1蛋白由两部分组成，一部分是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，即分子的C端(占该分子的1/2)，另一部分是N端的调节结构域，这个结构域在没有接受合适信号的情况下，抑制蛋白激酶的活性。

  为了检查Raf-1的作用，按照方案设想，改变了ATP结合区的一个关键氨基酸残基，构建一个显性负作用的raf-cDNA。这种突变的cDNA编码一个有缺陷的激酶蛋白质，命名为NAF(没有功能的Raf)。从raf-1 cDNA和NAF的cDNA制备了RNA，并将它们单独地或混合地注射到2细胞蛙胚胎中，以确定它们对蛙发育的影响。实验结果列于表025.3中。在某些注射体中，短尾的表型非常明显。

酶切图谱(图Q25.10)。发现样品2有点突变，使得B^*、C^*切割位点丢失。请设计一种实验方案，利用图中所示的DNA区段作为探针，进行指纹和RELP分析。

  图Q25.10 10kb片段二种酶切图谱

与信号转导有关。如何证实你的推测?

隆得到的野生型的基因去获得突变型?

酵母的两种不同的环状质粒DNA载体(YP1和YP2)用于将leu^-转化成leu⁺，从这两种质粒转化获得的leu⁺培养物，都能与leu^-表型的细胞交配。

  YP1leu⁺×leu^-→所有的子代表型都是leu⁺，所有子代的DNA都能与YP1特异探针显示阳性反应；

  YP1leu⁺×leu→一半的子代为leu⁺，能够与YP2特异的探针杂交，另一半为leu^-，不能与YP2特异探针杂交。

  解释这两种不同质粒转化造成的差异。

，图中所示数字的单位是kb。

  图Q25.11 假设的某病毒基因组DNA的限制性酶切图谱