打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在E.coli中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA的两侧具有BamH Ⅰ的位点，

打算在细菌中表达一种稀有的人类某种蛋白质，以便能够大量制备这种蛋白质。为确保分离纯化，决定将一段6个组氨酸的短肽加到该蛋白质的N端或C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同Ni²⁺柱结合，但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。

  图Q25.9是编码该蛋白质的核苷酸序列。请设计一对PCR引物，各含有18个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列。另外，在N端有一个起始密码，其后是6个组氨酸密码子。另设计一对引物，能够在C端加上6个组氨酸和一个终止密码。

  图Q25.9欲修饰蛋白质的N端和C端的核苷酸序列

  编码的氨基酸序列用一个字母标在下面。星号(*)代表终止密码。此图只标出了双链DNA上面的一条链

从E.coli中分离到一种hemA突变体，这种突变是不可恢复的，并且需要生长在琥珀酸的平板上才能利用δ-氨基乙酰丙酸合成血红素。希望利用该突变体去克隆E.coli的hemA基因。首先用Sau3A Ⅰ部分酶切E.coli的DNA，得到的DNA片段平均为2kb，然后将这些片段从BamH Ⅰ位点克隆到质粒pBR322中，连接后转化hemA突变体。根据氨苄青霉素抗性来选择重组体。将筛选到的氨苄青霉素抗性克隆重植在加有δ-氨基乙酰丙酸的平板上进行测试。请问：已经测试的Amp^r抗性转化子中有多少不再需要在培养基中添加琥珀酸?(E.coli基因组的全长为4500kb。)

raf-1基因编码一种对脊椎动物的发育有重要作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在果蝇中，当这个基因有缺陷时，胚胎在囊胚期的发育还是正常的，但此后的发育是不正常的，形成一个短尾的胚，也就是缺少后面的四段。在脊椎动物中，成纤维细胞生长因子(FGF)刺激中胚层的诱导和后期的发育，同时认为，Raf-1蛋白参与了由FGF启动的信号传递。Raf-1蛋白由两部分组成，一部分是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，即分子的C端(占该分子的1/2)，另一部分是N端的调节结构域，这个结构域在没有接受合适信号的情况下，抑制蛋白激酶的活性。

  为了检查Raf-1的作用，按照方案设想，改变了ATP结合区的一个关键氨基酸残基，构建一个显性负作用的raf-cDNA。这种突变的cDNA编码一个有缺陷的激酶蛋白质，命名为NAF(没有功能的Raf)。从raf-1 cDNA和NAF的cDNA制备了RNA，并将它们单独地或混合地注射到2细胞蛙胚胎中，以确定它们对蛙发育的影响。实验结果列于表025.3中。在某些注射体中，短尾的表型非常明显。

从两个人的血细胞中抽提DNA，并分别用A、B、C三种不同的限制性内切核酸酶进行切割，假定获得一长度为10kb的DNA酶切图谱(图Q25.10)。发现样品2有点突变，使得B^*、C^*切割位点丢失。请设计一种实验方案，利用图中所示的DNA区段作为探针，进行指纹和RELP分析。

  图Q25.10 10kb片段二种酶切图谱